?本期AVT小編給大家詳細介紹一下陽離子脂質(zhì)體制備過程中常用的5款脂質(zhì)，你知道這幾款熱門脂質(zhì)具體有哪些嗎？它們又有著怎樣的應用呢？快來了解下！

?就今年的盛夏時節(jié)，AVT可謂是火力全開，不僅帶來了高品質(zhì)高性價比的注射級蔗糖產(chǎn)品，siRNA脂質(zhì)體產(chǎn)品Onpattro的關鍵輔料DLin-MC3-DMA，還有DMG-PEG2000，DOTMA正式在艾偉拓上線！

?陽離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA

?DLin-MC3-DMA作為新型陽離子脂質(zhì)—可電離化陽離子脂質(zhì)的代表，具有“低毒高xiao”的優(yōu)勢，它的化學名為4-(N,N-二甲基氨基)丁酸 (6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂，分子式C₄₃H₇₉NO₂，是一種無色至淡黃色的油狀液體，pKa=6.44。

▲DLin-MC3-DMA

?DLin-MC3-DMA具有獨特的pH依賴性電荷可變特性：酸性條件下呈正電性，而生理pH條件下呈電中性。因此，核酸在酸性條件下被包裹，形成的脂質(zhì)體在血液中則具有很小的正電荷密度，即很低的細胞毒性。并且DLin-MC3-DMA陽離子脂質(zhì)體因具有正電性可增加粒子在體內(nèi)的溶酶體逃逸，提高轉(zhuǎn)染效率，而又不易被巨噬細胞吞噬。利用這些特性，DLin-MC3-DMA制備的陽離子脂質(zhì)體在siRNA遞送方面具有“低毒高xiao”的出色表現(xiàn)。

▲DLin-MC3-DMA結構式

?DLin-MC3-DMA的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DLin-MC3-DMA

?商品名：DLin-MC3-DMA

?化學名稱：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亞油基）甲酯

?分子式：C₄₃H₇₉NO₂

?生產(chǎn)商:艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：1224606-06-7

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?性狀：無色至淡黃色油狀液體

?純度：98%

?溶解性：不溶于水，易溶于DMSO、甲醇、乙醇。

?分子量：642.09

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

▲Onpattro

?2018年全球首ge用于治療治療家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變的siRNA脂質(zhì)體產(chǎn)品Onpattro在美上市，成功打開了沉默細胞基因藥物的大門。

?Onpattro中運用的陽離子脂質(zhì)材料DLin-MC3-DMA也開始備受關注。在這之前，DLin-MC3-DMA在國內(nèi)市場仍是一片空白。AVT基于深耕磷脂、脂質(zhì)體、脂肪乳方向多年的資源和經(jīng)驗，推出新產(chǎn)品DLin-MC3-DMA。為陽離子脂質(zhì)材料提供了一種“低毒高xiao”選擇。

?陽離子脂質(zhì)體，顧名思義，是粒子呈正電性的脂質(zhì)體制劑，所以提供正電性的陽離子脂質(zhì)是制劑關鍵。目前市場上最為常見且使用較多的陽離子類脂有DOTAP、DOTMA、DC-CHOL等，但它們在應用中都有著較大的細胞毒性，因此載藥量和安全性兩方面常難平衡。

陽離子脂質(zhì)DMG-PEG2000

?說起DMG-PEG2000這款陽離子脂質(zhì)材料在RNA藥物脂質(zhì)體中的應用情況，以DMG-PEG2000為代表的新型PEG化脂質(zhì)的應用優(yōu)勢在哪里呢？AVT推出了自己的新產(chǎn)品DMG-PEG2000，這款隨著新冠肺炎mRNA疫苗的火熱研制而被大家認識的脂質(zhì)新材料迅速躥紅，許多小伙伴只知道它和DSPE-mPEG2000一樣具有長循環(huán)作用且基因轉(zhuǎn)染效果更好，卻并不了解背后的具體原理。

?DMG-PEG2000英文全名1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000，中文名可對應翻譯為二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000。它的分子式為C₁₂₂H₂₄₂O₅₀，分子量2509.2（平均值），代表結構如下：

?從結構式上就能看出，該材料是通過PEG化修飾了一種短鏈脂質(zhì)，C14比常見的DSPE-mPEG2000的C18鏈短得多，這樣最直接的結果就是脂質(zhì)“錨”嵌插入脂質(zhì)膜較“淺”，在體循環(huán)過程中較易脫落。而這一設計zui大的優(yōu)勢是解決了“PEG-dilemma”。PEG-dilemma主要有三點：

?1、PEG鏈的空間位阻作用屏蔽脂質(zhì)體與細胞膜間的相互作用，抑制靶細胞對脂質(zhì)體的攝取；

?2、屏蔽脂質(zhì)體與內(nèi)涵體膜間的相互作用，妨礙“內(nèi)涵體逃逸”，導致RNA被降解無法順利進入細胞質(zhì)；

?3、多次注射PEG化脂質(zhì)體誘發(fā)免疫反應，引起加速血液清除（ABC）現(xiàn)象。

?一般的解決辦法有：降低脂質(zhì)體表面PEG的密度；使用可斷裂的PEG-脂質(zhì)間linker，如酯鍵、腙鍵、肽鍵；使用短鏈脂質(zhì)，如采用C14脂質(zhì)錨定較C18更易于PEG從粒子表面解離。另外，DMG-PEG2000的短鏈（肉豆蔻酸，C14）比長鏈（硬脂酸，C18）半衰期小可更快降解，DMG-PEG2000可降低脂質(zhì)體與細胞間的相互作用及吸附ApoE的能力，獲得zui好的細胞基因沉默效果。

?“溶酶體/內(nèi)涵體逃逸”是RNA類藥物遞送的關鍵也是難點，藥效高低與其直接相關。使用含有短烷基鏈的聚乙二醇脂質(zhì)，可在實現(xiàn)體內(nèi)逃逸的同時快速解離，以此對抗PEG化造成的“內(nèi)涵體逃逸”失敗現(xiàn)象。這也是為何DSPE-mPEG2000在化藥脂質(zhì)體中常用而核酸類脂質(zhì)體藥物使用DMG-PEG2000的基因沉默/表達水平更高、藥效zui好。

?DMG-PEG2000的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DMG-PEG2000

?商品名：DMG-PEG2000

?化學名稱：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000

?分子式：C₃₂H₆₂O₅(C₂H₄O)n, n≈45

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：160743-62-4

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?性狀：白色粉末

?溶解性：易溶于甲醇、氯仿，部分溶于水。

?分子量：約2509.2

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?DMG-PEG2000的圖譜信息是這樣的：

?▼ H NMR

?▼ C NMR

陽離子脂質(zhì)DOTMA

?近年來基因療法、抗體療法、免疫療法等概念鋪天蓋地，隨之大熱的基因遞送成為研究焦點。專注輔料開發(fā)的小編本以為這是一個新興領域，沒想到簡單調(diào)研后卻發(fā)現(xiàn)早在三十多年前科研工作者就已經(jīng)成功利用陽離子脂質(zhì)輔DMG-PEG2000的產(chǎn)品信息是什么？料制備脂質(zhì)體用于基因轉(zhuǎn)染了。接下來要介紹的DOTMA就有著這樣的背景。

?DOTMA誕生于1987年，由Felgner等人合成出來并應用于DNA的遞送。研究發(fā)現(xiàn)，DOTMA制備的單室脂質(zhì)體可高xiao包載DNA和RNA片段，包封率達百分之百，并且能夠很好的被細胞攝取進而表達目標基因，細胞水平上的轉(zhuǎn)染效率較DOTAP高10倍。處方也更簡單，不需要添加DOPE等helper lipid。然而DOTMA早先并沒有被國內(nèi)陽離子脂質(zhì)體研究者所熟知，反而DOTAP、DC-CHOL等應用更多。

?DOTMA中文名二油酰丙基氯化三甲銨，構效關系上兩條脂肪酸短鏈（C14）組成的脂質(zhì)體較長鏈（C16或C18）有著更好的轉(zhuǎn)染效果，結構式如下：

?容易與它混淆的DODMA是1，2-二油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷，兩者銨離子價位不同，帶電荷密度不同，自然在用法和效果方面也不一樣。

?RNA類藥物的效果與選用的陽離子脂質(zhì)材料密切相關，實驗中遇到問題的時候不妨多試幾種陽離子脂質(zhì)材料呀。

?DOTMA的基本信息是什么？

?通用名稱：DOTMA

?商品名：DOTMA

?中文名稱：二油酰丙基氯化三甲銨

?化學名稱：1,2-雙十八烯氧基-3-甲基銨丙烷 （氯鹽）

?CAS號：104872-42-6

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?分子式：C₄₂H₈₄ClNO₂

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?吸濕性：無

?性狀：白色固體

?純度：96%以上

?分子量：670.575

?熔點：35~38℃

?光敏性：有

?保存條件：-20℃

?DOTMA在RNA脂質(zhì)體中發(fā)揮了怎樣的作用？

?DOTMA作為一種性能優(yōu)xiu的陽離子脂質(zhì)材料被廣應用于非病毒基因轉(zhuǎn)染，如Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin。相較于DOTAP、DC-CHOL、DODMA等，它在擁有更高轉(zhuǎn)染效率的同時細胞毒性也更小，因此在藥用陽離子脂質(zhì)體開發(fā)中的研究也越來越多。

?DOTMA分子結構上具有“較大尾扇，較小頭部”的特性，在脂質(zhì)體微觀形態(tài)、體內(nèi)穩(wěn)定性以及與細胞膜相作用等方面較DC-CHOL、DOEPC等更好。DOTAP也具有類似的結構性質(zhì)，但DOTAP對DNA/RNA的包載效率不如DOTMA，在同等藥效下DOTAP劑量要比DOTMA高得多，隨之而來的細胞毒性也就更大，安全性不如DOTMA。RNA脂質(zhì)體的效果與其所用陽離子脂質(zhì)的飽和度（雙鍵數(shù)量）、側(cè)鏈長度、頭部基團、N價態(tài)等因素密切相關，DOTMA正是綜合了這幾方面的優(yōu)勢，因此具有很好的應用特性。一般處方設計時與膽固醇、PC類磷脂和PEG化脂質(zhì)合用。

?DOTMA的其它應用優(yōu)缺點整理如下：

?優(yōu)點：

??對核酸包載效率高，RNA/DOTMA脂質(zhì)復合物中RNA包封率可達百分之百；

??基因轉(zhuǎn)染效率高，某些細胞上能高出DOTAP處方10倍多；

??細胞毒性較小，安全性好；

??可GMP大規(guī)模生產(chǎn)。

?缺點：

??價格較高；

??轉(zhuǎn)染效率不如DLin-MC3-DMA等可電離陽離子脂質(zhì)；

??目前仍處于實驗室研究階段，沒有上臨床的產(chǎn)品。

?圖表引用自：

?R Kola?inac, C Kleusch. Deciphering the Functional Composition of Fusogenic Liposomes. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(2), 346.

陽離子脂質(zhì)DOTAP

?根據(jù)包載的API不同，可將陽離子脂質(zhì)體分為兩大類，一類是包載以mRNA、siRNA為代表的核酸類藥物的脂質(zhì)體，是基因治療中研究最多、應用最廣的一種非病毒載體；另一類是包載如紫杉醇、喜樹堿等小分子抗癌藥的脂質(zhì)體制劑，具有腫瘤新生血管靶向性，對癌癥也有雙重機制作用下的好療效。DOTAP是在陽離子脂質(zhì)體制備中使用最多的藥用輔料。

?常見的DOTAP（Cl），化學名為(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化銨，分子式C₄₂H₈₀NO₄Cl，分子量698.6，是一種季銨鹽，是帶正電荷的兩親性類脂化合物。因為生產(chǎn)工藝的不同，有些性狀呈淡黃色蠟狀，而工藝好的公司生產(chǎn)的DOTAP則是白色粉末，更便于稱量等實際操作。它是兩親分子，結構主要由極性頭部(親水基團)、連接基團、疏水尾部三部分組成。極性頭部通常由叔胺或季銨鹽構成，后來又研究出咪唑頭部、氨基酸頭部等。其極性頭部情況對核酸分子的包載效率以及細胞毒性均有重要的影響。因含雙鍵和正電荷，DOTAP光敏易氧化易吸濕，氧化后會發(fā)黃、變黏，因此實驗時操作需快。

?DOTAP最早應用的商業(yè)化產(chǎn)品是轉(zhuǎn)染試劑。DOTAP的極性頭部通過靜電作用與帶有負電荷的DNA分子穩(wěn)定結合，兩者混合后可自發(fā)形成穩(wěn)定的復合物。這種轉(zhuǎn)染方法非常溫和，可避免脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或者其它方式轉(zhuǎn)染帶來的細胞毒性作用，并且轉(zhuǎn)染效率高于其它的脂質(zhì)試劑。

?DOTAP的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DOTAP

?商品名：DOTAP

?化學名稱：（2,3-二油酰基-丙基）-三甲基銨-氯鹽；(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化銨

?分子式：C₄₂H₈₀NO₄Cl ? ?

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：132172-61-3

?級別：藥用試劑級別

?用途：陽離子脂質(zhì)體

?性狀：白色固體

?純度：99%

?分子量：698.56

?熔點：35~38℃

?保存條件：-20±5℃，遮光密閉

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?對于核酸藥物脂質(zhì)體而言，處方中DOTAP用量越大載藥量及轉(zhuǎn)染效率自然越高，但隨之而來細胞毒性也越大，制劑安全性受影響，因此兩者需平衡。學術部的同事曾做過小鼠實驗研究即毒性：當zeta電位高于+50mV時即有可能出現(xiàn)注射立即死亡現(xiàn)象。對于包載化療藥物而言，載藥并不依賴DOTAP，處方中可添加其它中性磷脂如DSPC、DPPC等，使用劑量方面受限較小。

?應用方面，DOTAP價格相對其它種類陽離子脂質(zhì)而言較低，性價比高，是應用最多的陽離子脂質(zhì)，已在人體上使用——正在進行III期臨床試驗EndoTAG-1。

?EndoTAG-1是將紫杉醇包埋于帶正電荷的脂質(zhì)體中所得的陽離子脂質(zhì)體。處方如下：

?與正常脈管系統(tǒng)不同，腫瘤內(nèi)皮由于缺乏糖蛋白涂層，進而會形成具有較大負電荷的細胞表面。EndoTag-1可選擇性吸附于帶負電荷的新生腫瘤血管內(nèi)皮細胞上，即只破壞腫瘤新生血管，不攻擊健康血管。而血管內(nèi)皮細胞是腫瘤生長必不可少的，因此EndoTAG-1除了API紫杉醇發(fā)揮抗癌作用外還因DOTAP提供的正電荷抑制腫瘤新生血管生成，雙重機制作用，可有效抑制腫瘤生長。其目前處于全球性的胰腺癌及三陰性乳腺癌III期臨床階段，由臺灣杏國藥業(yè)主導，計劃選擇10個國jia/地區(qū)進行，現(xiàn)已成功開展：美國、臺灣地區(qū)、法國、匈牙利、南韓、俄羅斯、以色列等七個國jia及地區(qū)的III期臨床試驗。在國內(nèi)，石藥的2類藥“注射用紫杉醇陽離子脂質(zhì)體”項目也使用的是DOTAP，于2019年獲CFDA批準進行乳腺癌的I期臨床。

?借鑒EndoTag-1我們可建立基于DOTAP陽離子脂質(zhì)體的技術平臺，包裹各類小分子化療藥物。如喜樹堿藥物陽離子脂質(zhì)體EndoTag-2，是基于拓撲異構酶I抑制劑原理的新型腫瘤新生血管靶向劑。DOTAP在小分子化療藥物的陽離子脂質(zhì)體開發(fā)上潛力巨大。

陽離子脂質(zhì)DC-CHOL

?相信對于關注陽離子脂質(zhì)體的小伙伴來說DC膽固醇較為熟悉，國內(nèi)外文獻里都有其大量的應用性質(zhì)研究及實驗數(shù)據(jù)的報導。作為制備陽離子脂質(zhì)體常用的正電荷脂質(zhì)，小編整理了一些DC-CHOL具有通用性的小知識來和大家做個分享。

?DC-Chol，化學名3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇，分子式C₃₂H₅₇N₂O₂Cl，是一種膽固醇衍生物，無光敏性，引濕性，不易氧化，性質(zhì)較DOTAP更穩(wěn)定。是制備陽離子脂質(zhì)體常用的正電荷脂質(zhì)之一，穩(wěn)定脂質(zhì)體膜結構的同時為粒子提供正電性，且細胞毒性較DOTAP小。

?DC-Chol產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：DC膽固醇（供注射用）

?商品名：DC-CHO

?化學名稱：3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽

?分子式：C₃₂H₅₇ClN₂O₂

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：166023-21-8

?級別：試劑級

?用途：脂質(zhì)體

?性狀：白色粉末

?純度：98%

?溶解性：可溶于水（部分混溶），易溶于甲醇、乙醇、氯仿、DMSO

?分子量：537.26

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?在陽離子脂質(zhì)體的制備中，DC-Chol與合成磷脂DOPE是好搭檔，一般常用比例1:1或3:1，此外，處方中也常加入PEG化磷脂配合使用。大量文獻報道，DC-Chol/DOPE是低毒高xiao的核酸轉(zhuǎn)染組合，在表達目標基因、提高治療性疫苗細胞免疫方面十分有效。

?除了應用于治療疾病的藥物外，DC-Chol在陽離子脂質(zhì)體微泡超聲造影劑/超聲探針領域也有大量研究和較為普遍的應用。目前應用的微泡通常少量攜帶電荷或不帶電荷,基因攜帶量難以滿足治療需要。使用DC-Chol制備的新型陽離子超聲造影劑可高xiao包載基因并明顯提高體內(nèi)顯影能力。

助磷脂DOPE為什么經(jīng)常出現(xiàn)在脂質(zhì)體處方中？

?在脂質(zhì)體制劑的制備過程中，你可能在處方中經(jīng)常看到二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE的身影，一般來說，正常的陽離子脂質(zhì)體處方中需含有陽離子脂質(zhì)、膽固醇、中性助磷脂以及PEG化磷脂，各種脂質(zhì)成分的選擇經(jīng)常是因項目不同而各異，但在查閱文獻過程中大家都會發(fā)現(xiàn)一個共同點，那就是處方中常出現(xiàn)DOPE的身影，這是為什么呢？

?DOPE可說是非常常用的助磷脂（helper lipid），在制備陽離子脂質(zhì)體過程中具有很強的協(xié)同作用，主要原理如下：

?1、中性不穩(wěn)定助類脂：起穩(wěn)定雙層膜和降低陽性成分毒性的作用。

?2、干擾類脂膜，使內(nèi)涵體膜不穩(wěn)定：在細胞內(nèi)能促進DNA、RNA的釋放，同時輔助陽離子脂質(zhì)體的細胞滲透。

?3、能夠確定核酸+脂質(zhì)體復合物的形態(tài)，可是脂質(zhì)體結構從多相Lα相躍遷到六角HII相，使復合物具有良好的可融性，能顯zhu提高跨膜效率。

?因此，DOPE的加入可使得陽離子脂質(zhì)體膜融合更好、穩(wěn)定性更高、細胞毒性更小。大量研究表明類脂聚合物單獨作用時不能轉(zhuǎn)染細胞，而加入DOPE能解決這個問題，比如使用DC-Chol/DOPE可表達CAT基因，而復合物DC-Chol/DOPC則沒有活性。

?DOPE這款磷脂的產(chǎn)品信息是什么？

?中文名稱：二油酰磷脂酰乙醇胺

?商品名：DOPE

?化學名稱：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

?英文化學名稱：1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine

?分子式：C₄₁H₇₈NO₈P

?生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

?CAS號：4004-5-1

?DMF號：28884

?EINECS：200-663-8

?級別：藥用試劑級別

?執(zhí)行標準：企業(yè)標準

?用途：脂質(zhì)體

?溶解性：不溶于水，可溶于氯仿、甲醇、乙醇

?分子量：744.03

?保存條件：-20℃

?注意事項：避免與強酸、強堿、強氧化性物質(zhì)接觸

?本期對陽離子脂質(zhì)體制備中這5款常用的陽離子脂質(zhì)的介紹先到這里，從2007年至今，AVT專注脂質(zhì)體、脂肪乳、微納米靶向制劑等遞藥體系，堅持以藥用輔料為主要業(yè)務方向，"高校+研究所+藥企"拓展模式，已覆蓋中國所有相關企業(yè)。

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